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一封信的签字者

1991年,研究生毕业之前,申请博士后奖学金。Helen Hay Whitney博士后奖学金是美国生物医学比较重要的之一,那时每年约20人。

几十年的名单中,不乏美国著名科学家。

早先华人很少,以后逐渐增加。九十年代初可能每年1-2位华人。

记忆深刻的不是以上,而是1991年1月18日基金会正式通知信的签名者:HHW基金会的学术委员会主席Maclyn McCarty。

他是1944年,Avery,MacLeod、McCarty经典论文的三位作者之一。他们在《实验医学杂志》发表肺炎球菌转化因子的论文,提出DNA是遗传的物质基础。

这篇文章是二十世纪最重要的生物学论文。

二十世纪生物学第二重要的论文是1953年Watson和Crick的DNA双螺旋模型。

1944年的发现比1953年的发现更为重要:

    如果1944年没有发现DNA是遗传物质,Watson和Crick不会研究DNA的结构;

    如果DNA不重要,研究其结构也就没有很大意义;

    无论双螺旋多么漂亮,其核心是功能的重要性。

Avery、MacLeod、McCarty没有获奖,与Avery年龄有关。1944年他已经67岁,属罕见的在高龄做出最重要贡献的科学家之一,而当时诺奖委员会有人还不信,拖了时间。

据诺奖五人委员会当时核酸专家Hammarsten的学生Reichard(2002)在研读解密的文件后介绍,1932年至1946年几乎每年Avery都因发现细菌多糖的抗原性而被提名诺贝尔奖。1946年后提名开始提到他的转化工作,但当时诺贝尔医学奖委员会懂核酸的关键成员Hammarsten虽首先提议委员会考虑这一工作,但他每次都认为不行,前几年是考虑到提取物易污染、难排除蛋白质起转化作用的可能性,等到1952年Hershey和Chase文章、1953年Watson和Crick文章后,他和其他成员相信DNA是转化因子,Hammarsten的评估报告认为DNA是转化因子,但其作用机理不明、所以得奖还早。1953年诺奖给三羧酸循环的发现者Hans Krebs(1900-1981)和辅酶A的发现者Fritz Lipmann (1899-1986)、1954年奖给脊髓灰质炎病毒的发现者们。而1955年Avery去世后,核酸方面的诺贝尔奖都比较快,包括1959年发错了一半。

对于当时仅33岁的McCarty,还有很长年代。而Horace Judson于1979年出版的The Eighth Day of Creation一般认为很好的有关分子生物学历史的书。但是,他依赖访谈,不善阅读关键原始论文,对Avery等工作理解不够充分、不清楚1946年的文章,且未采访当时健在的MacLeod和McCarty。不得已,1985年McCarty自己出书,有更可靠的一手材料(McCarty,1985)。

以下来自《生物学概念与途径》第三章:

Avery在缅因州度假写文章,McCarty写实验方法,MacLeod写前期的结果,Avery提出是否按资历、与课题相关时间排作者顺序也不一定合适,可能按字母顺序,McCarty说两种方法的结果都是一样的:Avery、MacLeod、McCarty,同意。1943年10月Avery向洛克菲勒研究人员宣读研究结果,当时只有鼓掌、无人提问。11月1日Avery把稿件交给洛克菲勒主板的《实验生物学杂志》的主编Peyton Rous(1879-1970),Rous对稿件有修改建议,包括要求删除“核酸的重要性能否与氨基酸链相媲美成为一个问题”。1944年2月1日文章出版。

3-9转化因子(Transforming Principle)

1944年Avery、MacLeod、McCarty共同发表论文(Avery, MacLeod and McCarty,1944),一般认为与Watson和Crick(1953)并列为二十世纪生物学最重要的文章。

Avery-MacLeod-McCarty开篇高屋建瓴,完全不同于前面一系列限于肺炎球菌的文章,而是将问题提高到遗传的分子机理层面。首先指出很多生物学家试图用化学的方式在高等生物诱导特异、可预见、能够遗传的变化。其次认为微生物中可以实验诱导、重复发生的、可遗传的特殊变化最好的例子是肺炎球菌型的转化实验。其后他们简介Griffith的实验结果,以及Dawson、Alloway等的进一步工作。

Avery-MacLeod-McCarty的研究目的是找有转化活性的因子(principle),并初步确定其化学性质、化学分子的类型。达到宏大的目标需要能解决问题的具体方法。用来获得提取物的是III型S类菌株(A66),与被转化的II型R类有很大的形态和大小差别。用于检测转化活力的细菌,需不易自身转变、而同时对转化活性有反应,这就是MacLeod用II型S传36代后获得的R36A菌株。他们注意到即使是R36A还可衍生不同的菌株,有些可被转化、有些不能,而R菌破损释放的酶能降解S菌的转化活性,所以需选生长良好的R以免检测的不稳定。转化实验用的培养液,MacLeod用炭可去除不稳定性。以前谢和平与Dawson认为血清提供抗R的抗体,Avery-MacLeod-McCarty认为与抗体无关,但仍需血清的某种其他成分,因血清含灭活转化活性的酶,需将血清加热到60°C,灭活此酶。他们采用Sevag (1934)发明的方法用氯仿去除蛋白质、接着用乙醇多次沉淀。用Avery实验室发现的降解多糖的酶去除多糖,再逐滴用乙醇达到临界浓度沉淀活性物质,得到絮状纤维沉淀,用小棒搅出来再溶解。乙醇沉淀DNA的方法是Mirsky告诉McCarty(Mirsky and Pollister, 1942;Darnell,2011)。

提取的活性物质在生理盐水中很稳定可保存数月、但在水中不稳定,65°C一小时不能灭活。用两种检测蛋白质的方法(双缩脲和Millon检测)结果显隐性,用DNA的检测方法(Dische氏二苯胺反应)显强阳性,RNA检测方法(Bial氏地衣酚反应)显弱阳性,但他们用同样浓度的提取的胸腺DNA看到用地衣酚反应也显弱阳性。反复用乙醇和乙醚提取不降低活性,推测活性分子不是脂肪。

他们请同事对四批提取的转化物质进行了元素含量检测,含C约34%、H约3.8%、N约15%、P约9%,都接近纯化的胸腺DNA中元素的含量(34%、3.2%、15%、9%)。N/P比例为1.58到1.75,也接近DNA预计值1.69。

他们从洛克菲勒的酶专家Northrop和Kunitz获结晶纯的胰蛋白酶、糜蛋白酶和RNA酶,它们都不能灭活转化因子,说明转化活性非RNA、也非这些蛋白酶能降解的蛋白质。

他们从几种动物组织制备粗提物,a狗小肠粘膜、b兔骨磷酸酶、c猪肾磷酸酶、d肺炎球菌自溶物、e狗和兔血清。在酶活性方面,他们观察到这些粗提物除d外都有磷酸酶活性、除c外都有甘油三丁酸酯酶活性、除b和c外都有DNA酶活性(检测DNA酶活性的DNA由洛克菲勒的Mirsky提供)。他们发现只有a、d和e能够灭活转化物质,比较磷酸酶、酯酶和DNA酶活性的相关性后,这些结果支持DNA是转化因子。

他们用不同温度和时间处理狗和兔血清,观察到热灭活DNA酶活性负相关于这些制备对转化因子的灭活。而温度灭活血清中甘油三丁酸酯酶的活性与转化活性无关。这些结果也与DNA是转化因子相一致。

他们试了一些化合物能否抑制灭活转化因子的酶,发现氟化钠有显著作用,它可以抑制所有已知来源(如肺炎球菌、狗小肠粘膜、胰腺、血清)的DNA酶的活性,也抑制这些来源DNA酶制备物对转化因子的灭活,进一步支持DNA与转移因子的相关性。

转化因子本身对III型抗血清无反应,不是III型的抗原本身,也就不是荚膜多糖。

他们请生物物理学家Alexandre Rothen分析,发现在超速离心中,转化物质显示均质性和非对称性,分子量约50万。电泳行为也显示类似核酸的一种分子。UV光谱显示吸收峰在260nm,也与核酸一致。

转化因子活性很强:2.25毫升溶液含0.003微克仍有活性,六亿分之一的比浓度。

在讨论中,他们说从III型肺炎球菌分离了DNA组分可以将II型衍生的无荚膜R类菌转化为完整荚膜的III型菌。肺炎球菌有RNA是1938年洛克菲勒的`科学家所发现(Thompson and Dubos,1938),而1944年前尚无人报道肺炎球菌的DNA。他们强调转化因子的化学性质不同于其导致产生的荚膜多糖。他们指出“本文所呈现的资料强烈提示核酸,至少是脱氧类型的,具有转化因子选择性作用所证明的不同特异性”。他们也知道细菌一旦被转化后,获得的性状可以传代,转化带来的变化“可预计、有型的特异性、可遗传”。

对转化的机理,Avery-MacLeod-McCarty讨论了三种,其中第二种是遗传学家Theodosius Dobzhansky(1900-1975)提到的转化可能是遗传突变(“如果转化被描述为遗传突变—很难避免如此描述—我们就在面对特别处理导致特异突变的真实例子”) (Dobzhansky,1941),Avery-MacLeod-McCarty认为这是比拟转化因子是基因。

他们承认还可能有其他物质吸附在核酸上起作用。但如果确实能证明就是核酸起转化作用,那么核酸应该具有尚未确定化学基础的生物学特异性。

全文的结论:出示的证据支持脱氧类的核酸是III型肺炎球菌转化因子的根本单位(the evidence presented supports the belief that a nucleic acid of the desoxyribose type is the fundamental unit of the transforming principle of Pneumococcus Type III)。

Avery-MacLeod-McCarty(1944)的文章是1943年11月提交,措辞含蓄可能是因为Avery早期错过一次而在提出多糖抗原时也经历过争议有经验。而在1943年5月26日Avery在给自己弟弟的信中,他清楚地说明转化是可以遗传、可以预计的变化,可能是基因(Dubos,1976)。

1945年,英国神经药理学家、1936年诺贝尔奖得主Henry Dale(1875-1968)在给Avery发英国皇家学会的Copley奖时,提到Avery发现了基因(Dale,1946)。而诺贝尔奖委员会受其研究核酸的成员Hammarsten影响直到1952年以前都不认同DNA是遗传的物质基础(Reichard,2002)。

1943年Avery到了强制性退休年龄,但二战期间美国怕出现战时传染病而请微生物学家为国家工作,洛克菲勒医学研究所也给Avery荣誉研究员、实际继续主持实验室。终生未娶的Avery于1947年离开纽约去田纳西州,与任教Vanderbilt大学微生物系的弟弟Roy Avery(1885-1971)比邻而居过退休生活,1955年去世。

 



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